引言

       全球“染”防控形势严峻，新技术“宏基因组二代测序技术 (mNGS) ”为疑难危重感染提供快速精准诊断依据，指导抗生素的合理应用。以上海华山医院、北京协和医院、首都儿科研究所附属儿童医院为代表的一线临床工作者在破解疑难杂症，成功救助患者的过程中，也收获了丰硕的科研成果，进一步推进了新技术的推广普及，更好地助力精准医疗。

       背景介绍

       据WHO对2015年全球死亡原因统计，全球因感染死亡的人数将近1000万，占全部死亡原因的17%^[1]。各类感染性疾病 (包括法定传染病) 防控形势严峻，国家公共卫生部门面临着重大挑战。

       目前，感染与非感染性疾病的鉴别和感染病因探寻仍是临床工作者的两大难题。每年细菌或真菌入血导致的细菌血症或真菌血症超过300万例，死亡率高达20%^[2][3]；每年中枢神经系统感染超过500万例，不同种类病原感染导致的死亡率从15%-70%不等^[4]。2015年共有约320万呼吸系统感染死亡案例，其中约有92万儿童 (<5岁) 死于肺炎，占该年龄段儿童死亡原因的16%^[5]。

       这些感染案例中，超过30%的肺炎^[6]、40-50%的脓毒血症^[7]以及高达50%-60%的脑炎脑膜炎病因不明^[8]。技术层面的局限是不能鉴明病因的主要因素。目前临床感染的常规诊断方法血培养方法只能培养细菌/真菌，阳性率仅有8-12%；而病毒PCR检测靶标有限，且大幅度依赖临床医生的经验，因此临床亟需新的诊断技术助力诊治。

       华大基因研发的基于宏基因组二代测序技术 (mNGS) 的感染病原基因检测，很大程度解决了临床感染诊治的部分难题。mNGS不依赖培养技术，直接获取临床样本 (血液、脑脊液、肺泡灌洗液等)，应用mNGS和生物信息分析软件全面鉴定细菌、病毒、真菌、寄生虫，为疑难危重感染提供快速精准诊断依据，指导抗生素的合理应用。

       仅2017年这一年，华大基因已经用该技术24小时快速鉴定狂犬病毒为临床提供诊断依据；确证疑难结核性脑膜炎，帮助颅内感染的菲律宾船员安全回家；检出利什曼原虫，让颈部淋巴结肿大、辗转7家医院花费30万的患者查出真实病因…

       为了推进mNGS技术在疑难危重感染方面的应用，华大基因与国内多位顶级临床专家开展了科研合作项目，近期连续发表了4篇研究论文。

       新思路：动态监测mNGS序列数可评估患者疗效？

       mNGS除了快速鉴定病原菌以外，能否多次采集不同治疗时间段的样本测序，根据检出序列数来评估患者用药前后是否好转呢？上海华山医院感染科张文宏团队最新发表在《Journal of Infection》的文章报道了最新研究进展^[9]。

       本文报导了mNGS鉴定4例未明病因的疑难发热患者病因的案例。mNGS分别检出4位患者感染结核杆菌、新生隐球菌、水痘带状疱疹病毒 (VZV)、铜绿假单胞菌。前3例患者随着针对性治疗，脑脊液中的葡萄糖和蛋白水平与mNGS检出序列数均呈下降趋势，反映出患者疾病治疗效果较好；而第4例铜绿假单胞菌感染患者，脑脊液中的葡萄糖和蛋白水平与mNGS的检出序列数呈上升趋势，反映患者疾病出现恶化。

       本文对临床的疑问给出了明确的回复，即mNGS检出序列数可以半定量的反映脑脊液中病原体的载量，进一步协助临床监测疾病进展和治疗效果。未来随着mNGS在临床病原菌检测方面的全面应用和成本控制，mNGS可以帮助实现患者疾病进展监测和疗效评估。

4例感染患者不同时间段mNGS测序结果

       中国首例：mNGS助力诊断神经性布氏杆菌病 (NB)！

       布氏杆菌病是由布氏杆菌引起的人畜共患的传染病，每年全世界有超过50万例的布氏杆菌感染报导。布鲁氏菌感染引发的临床症状多样，且常累及多脏器，中枢神经系统 (CNS) 感染布氏杆菌常被称为神经型布氏杆菌病 (NB)。常规的培养和血清学检测法敏感性和特异性都不高，mNGS技术的快速发展促使其成为用于CNS病因诊断的热点。

       全球目前仅有1例mNGS用于神经性布氏杆菌病 (NB) 的案例报导，北京协和医院神经科关鸿志团队则首次在《International Journal of Infectious Diseases》发表了国内mNGS用于临床中枢神经系统 (CNS) 感染患者布氏杆菌检出的文章^[10]。研究者采集了2016年6月1日至2017年6月1日临床怀疑CNS感染患者的脑脊液样本。mNGS快速检出4例患者布氏杆菌感染，结合临床症状和RT-PCR结果验证，患者确诊为神经型布氏杆菌病。mNGS检出序列数从11-104不等，覆盖度从0.0043%-0.4%不等。4例布氏杆菌感染的确诊，展现了mNGS在临床疑难感染病原检测应用的突出优势。

       经验+新技术：8月龄女童2周不明发热终于出院！

       儿童CNS的感染是神经内科常见病。脑脊液和血清病原抗体检测、病原培养和形态学鉴定等常规检测方法都有一定的局限性，导致部分患儿感染病因不能快速明确，而mNGS技术的优势则在这一领域凸显。

       首都儿科研究所附属儿童医院张建昭团队、北京协和医院关鸿志团队在《中华儿科杂志》上发表了mNGS在儿童CNS感染方面应用的临床案例^[11]。

       8月龄女患儿因“发热12天，间断抽搐8天，睡眠增多6天”就诊，持续间歇性高热和抽搐。通过mNGS技术检出单纯疱疹病毒1型 (HSV-1) 序列数高达35078条，占比99.66%，覆盖度为95%，在相对比例和病毒基因组覆盖度方面都达到了明确诊断HSV-1感染的强度。随后甘露醇降颅压后，阿昔洛韦抗病毒及其他对症治疗后患儿痊愈出院。本文表明除不容易发现的病原外，mNGS针对较为常见的疱疹病毒具有明确诊断意义，为临床不明原因的CNS感染性疾病提供了重要的病原学诊断方法。

患儿脑脊液二代测序结果

       最新评述：脑炎病因诊疗进展10年回顾

       脑炎病因不明，无法及时精准诊治是困扰临床的难题。过去10年里，新技术的应用和新知识的积累促使脑炎在病因诊断方面取得了极大进展，从而帮助越来越多的脑炎患者获得精准治疗。

       自身免疫系统紊乱和致病微生物如细菌、病毒和微生物等侵袭是导致脑炎发生的两大主因。自身免疫脑炎和感染性脑炎各有什么特点和研究进展呢？北京协和医院神经科关鸿志、崔丽英、儿科宋红梅最新发表在中华儿科杂志的述评则系统性的从自身免疫性脑炎和感染性脑炎两方面回顾了脑炎诊疗的进展^[12]。

       在感染性脑炎方面，嗜神经性病毒是感染性脑炎的主要病因，常规需要依靠血清学和PCR确诊，而mNGS的临床应用将感染性脑炎的诊断带入”测序“时代。mNGS除鉴定常规CNS感染病原菌外，也可用于发现未知的新型病原体，通过与临床、微生物学家、生物信息分析等多学科专家的共同合作，mNGS将会有效促进我国脑炎的诊疗水平。

       结语  

       mNGS技术正在处于临床应用的发展阶段，也面临着诸多挑战，如标本采集规范的建立，生物信息分析流程标准化设置，检测报告的专业性解读等。但所谓创新技术，就是在过去异想天开，在今天勉为其难，在未来习以为常。相信随着mNGS技术在临床的普及应用，会进一步助力精准医学，救助更多患者！

       参考文献：

       [1] WHO. Global Health Estimates (GHE), 2016. [Accessed 25 Sep 2017.] Available from URL: http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/en/

       [2] Reinhart, K., Daniels, R., et al. (2017). Recognizing sepsis as a global health priority—A WHO resolution. New England Journal of Medicine, 377(5), 414-417.

       [3] Fleischmann, C., Scherag, A., et al. (2016). Assessment of global incidence and mortality of hospital-treated sepsis. Current estimates and limitations. American journal of respiratory and critical care medicine, 193(3), 259-272.

       [4] John, C. C., Carabin, H., et al. (2015). Global research priorities for infections that affect the nervous system. Nature, 527(7578), S178-S186.

       [5] WHO. Pneumonia, 2016. [Accessed 7 Feb 2017.] Available from URL:http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en/

       [6] Dahyot, S., Lemee, L., & Pestel-Caron, M. (2017). Description and role of bacteriological techniques in the management of lung infections. Revue des maladies respiratoires.

       [7] Gavrilov, S. N., Skachkova, T. S., et al. (2016). Contemporary molecular-genetic methods used for etiologic diagnostics of sepsis. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii, i immunobiologii, (2), 91-99.

       [8] Glaser, C. A., Honarmand, S., et al. (2006). Beyond viruses: clinical profiles and etiologies associated with encephalitis. Clinical Infectious Diseases, 43(12), 1565-1577.

       [9] Ai, J. W., Zhang, H. C., Cui, P., Xu, B., Gao, Y., Cheng, Q., ... & Zhang, W. H. (2017). Dynamic and direct pathogen loads surveillance to reflect disease progression and therapeutic efficacy in central nervous system infection using a novel semi-quantitive sequencing platform. Journal of Infection.

       [10] Fan Siyuan, Ren Haitao, Wei Yanping, Mao Chenhui,Ma Zhenzi, Zhang Lu, Wang Li, Ge Ying, Li Taisheng, Cui Liying, Wu Honglong, Guan Hongzhi. Next-generation sequencing of the cerebrospinal fluidin the diagnosis of neurobrucellosis. International Journal of Infectious Diseases

       https://doi.org/10.1016/j.ijid.2017.11.028

       [11] 张建昭, 陈倩, 郑萍, 等.  二代测序诊断幼儿单纯疱疹病毒1型脑炎一例 [J]. 中华儿科杂志,2017,55( 11 ): 862-863. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2017.11.015

       [12] 关鸿志, 宋红梅, 崔丽英. 开启脑炎诊疗的精准医学之门 [J]. 中华儿科杂志,2017,55( 11 ): 801-804. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0578-1310.2017.11.001